準(zhǔn)確測(cè)定有機(jī)化合物的分子結(jié)構(gòu)，對(duì)從分子水平去認(rèn)識(shí)物質(zhì)世界，推動(dòng)近代有機(jī)化學(xué)的發(fā)展是十分重要的。采用現(xiàn)代儀器分析方法，可以快速、準(zhǔn)確地測(cè)定有機(jī)化合物的分子結(jié)構(gòu)。在有機(jī)化學(xué)中應(yīng)用最廣泛的測(cè)定分子結(jié)構(gòu)的方法是四大光譜法：紫外光譜、紅外光譜、核磁共振和質(zhì)譜。紫外和可見光譜（ultraviolet and visible spectrum）簡(jiǎn)寫為UV。

紫外光譜的發(fā)展史：1852年，比爾(Beer)參考了布給爾(Bouguer)1729年和朗伯(Lambert)在1760年所發(fā)表的文章，提出了分光光度的基本定律，即液層厚度相等時(shí)，顏色的強(qiáng)度與呈色溶液的濃度成比例，從而奠定了分光光度法的理論基礎(chǔ)，這就是著名的朗伯比爾定律。1854年，杜包斯克(Duboscq)和奈斯勒(Nessler)等人將此理論應(yīng)用于定量分析化學(xué)領(lǐng)域，并且設(shè)計(jì)了第一臺(tái)比色計(jì)。到1918年，美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)局制成了第一臺(tái)紫外可見分光光度計(jì)。此后，紫外可見分光光度計(jì)經(jīng)不斷改進(jìn)，又出現(xiàn)自動(dòng)記錄、自動(dòng)打印、數(shù)字顯示、微機(jī)控制等各種類型的儀器，使光度法的靈敏度和準(zhǔn)確度也不斷 提高，其應(yīng)用范圍也不斷擴(kuò)大。紫外可見分光光度法從問世以來(lái)，在應(yīng)用方面有了很大的發(fā)展，尤其是在相關(guān)學(xué)科發(fā)展的基礎(chǔ)上，促使分光光度計(jì)儀器的不斷創(chuàng)新，功能更加齊全，使得光度法的應(yīng)用更拓寬了范圍。

紫外分光光度計(jì)工作原理：1、物質(zhì)的吸收光譜本質(zhì)上就是物質(zhì)中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波長(zhǎng)的光能量，相應(yīng)地發(fā)生了分子振動(dòng)能級(jí)躍遷和電子能級(jí)躍遷的結(jié)果。由于各種物質(zhì)具有各自不同的分子、原子和不同的分子空間結(jié)構(gòu)，其吸收光能量的情況也就不會(huì)相同。因此，每種物質(zhì)就有其特有的、固定的吸收光譜曲線，可根據(jù)吸收光譜上的某些特征波長(zhǎng)處的吸光度的高低判別或測(cè)定該物質(zhì)的含量，這就是分光光度定性和定量分析的基礎(chǔ)。

2、又因?yàn)樵S多物質(zhì)在紫外-可見光區(qū)有特征吸收峰，所以可用紫外分光光度法對(duì)這些物質(zhì)分別進(jìn)行測(cè)定（定量分析和定性分析）。紫外分光光度法使用基于朗伯-比耳定律。

3、朗伯-比耳定律(Lambert－Beer)是光吸收的基本定律，俗稱光吸收定律，是分光光度法定量分析的依據(jù)和基礎(chǔ)。當(dāng)入射光波長(zhǎng)一定時(shí)，溶液的吸光度A是吸光物質(zhì)的濃度C及吸收介質(zhì)厚度l(吸收光程)的函數(shù)。

4、首先確定實(shí)驗(yàn)條件，并在此條件下測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的吸收峰以及其對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)值（同時(shí)可獲得該物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)）；再在選定的波長(zhǎng)范圍內(nèi)（或最大波長(zhǎng)值處），分別以（不同濃度）標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度和溶液濃度為橫、縱坐標(biāo)繪出化合物溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到其所對(duì)應(yīng)的數(shù)學(xué)方程；接著在相同實(shí)驗(yàn)條件下配制待測(cè)溶液，測(cè)得待測(cè)溶液的吸光度，最后用已獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出待測(cè)溶液中所需測(cè)定的化合物的含量。

5、具有芳香環(huán)或共軛雙鍵結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物，根據(jù)在特定吸收波長(zhǎng)處所測(cè)得的吸收度，可用于藥品的鑒別、純度檢查及含量測(cè)定。

紫外分光光度計(jì)難點(diǎn)——校正方法：紫外分光光度計(jì)的校正方法：分光光度法的最重要的一個(gè)物理化學(xué)量是吸光度。為了獲得準(zhǔn)確的研究結(jié)果，準(zhǔn)確測(cè)得樣品溶液的吸光度是非常重要的。一般，分析結(jié)果的不可靠性與偶然誤差和系統(tǒng)誤差有關(guān)。偶然誤差影響測(cè)量的精密度，可通過足夠數(shù)量測(cè)量的統(tǒng)計(jì)處理來(lái)減少;系統(tǒng)誤差影響測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確度，可在大體相同實(shí)驗(yàn)條件下，用比較一種物質(zhì)的準(zhǔn)確測(cè)量結(jié)果，使系統(tǒng)誤差統(tǒng)一起來(lái)。而分光光度計(jì)的系統(tǒng)誤差(波長(zhǎng)校正、分光光度計(jì)的慢散光、放大器的線性響應(yīng)、暗電流和比色皿的光程)和操作誤差(溫度改變、儀器讀數(shù)、操作者的改變、使用物質(zhì)的純度、稱量和濃度、pH)對(duì)測(cè)量吸光度的影響是可以檢查和校正的。關(guān)于操作誤差，多數(shù)情況下，通過嚴(yán)格按操作程序測(cè)量、儀器調(diào)零、準(zhǔn)確稱量等來(lái)控制或減少這種誤差的產(chǎn)生。關(guān)于儀器的系統(tǒng)誤差，可通過對(duì)分光光度計(jì)的定期校正來(lái)克服，若所需準(zhǔn)確度很高的測(cè)量，則必須天天校正。

紫外分光光度計(jì)難點(diǎn)——讀數(shù)不穩(wěn)定：1、先不放比色皿，看儀器是否漂移。如果不漂移，說明儀器正常。

2、放入空白溶液比色皿調(diào)零，讀數(shù)漂移到一定數(shù)值后，取出比色皿看一下，內(nèi)壁是否有極細(xì)小的氣泡。

一般紫外光度計(jì)讀數(shù)不穩(wěn)定的根本原因應(yīng)該有兩類：一類是能量降低，信噪比下降，這個(gè)可能性比較大；另一類是信號(hào)接收和處理故障。

1、能量降低

（1） 比色皿

如果是在400nm以下波長(zhǎng)測(cè)量，需使用石英比色皿，假如使用普通玻璃比色皿會(huì)吸收大部分的紫外能量。還有比色皿一般有光面和毛面之分，毛面是手捏的，光面是對(duì)正光路的。

（2）樣品架：

檢查樣品架是否在正確的槽位上，光是否全部照在比色皿上。方法是把波長(zhǎng)設(shè)定到550nm左右，這時(shí)是比較明亮的黃綠色光，在樣品室內(nèi)用個(gè)小紙片擋下就能看到光斑。這個(gè)方法也能檢測(cè)可見區(qū)的光源是否正常，濾光盤及波長(zhǎng)驅(qū)動(dòng)是否正常。

（3）空白樣品

樣品室不放任何東西對(duì)空氣調(diào)零，看是否穩(wěn)定。如果穩(wěn)定的話，應(yīng)該是空白樣品本身吸光度太高了。方法是先對(duì)空氣調(diào)零，然后把空白樣品放入光路中看讀數(shù)。如果讀數(shù)很大，例如接近3A，則不可用。

（4）光源

先確認(rèn)分析波長(zhǎng)值，一般紫外可見有2個(gè)光源，紫外區(qū)用氘燈，可見區(qū)用鎢燈，切換點(diǎn)一般在340nm-400nm。鎢燈光較為明亮刺眼，氘燈光偏青紫色。如果儀器后面有透光窗口可以直接看，如果沒有的話，需要打開外殼，打開燈室罩。光源都是用壽命的，能量變?nèi)趸蚋纱嗖涣亮?，要換燈。也有比較小的可能是光源供電電路故障，例如電源老化后可能導(dǎo)致無(wú)法正常點(diǎn)亮氘燈。

（5）光路

看光路是否偏了，可以把波長(zhǎng)設(shè)定到550nm左右，觀察樣品室內(nèi)有無(wú)黃綠色光線，光斑能否正確照在接收器窗口上。確認(rèn)燈室內(nèi)光源光斑是否正確照在單色器入狹縫上，確認(rèn)光路中有無(wú)雜物擋住。確認(rèn)單色器內(nèi)反射鏡、透鏡、光柵、濾光片等是否發(fā)霉或積滿灰塵，這個(gè)需要廠家才能處理。

（6）驅(qū)動(dòng)電路故障

例如濾光盤驅(qū)動(dòng)異常，導(dǎo)致濾光片用錯(cuò)或者干脆光路被遮擋。一般廠家或?qū)I(yè)人員處理。

2、信號(hào)接收和處理故障

接收器（例如光電池或者光電倍增管）、放大電路、AD轉(zhuǎn)換電路等都有可能。這類問題一般由廠家或?qū)I(yè)人員處理。